PCR
Nachweis von MRSA mit Hilfe der PCR (Polymerase Chain Reaction) umgangssprachlich auch „Schnelltest“ genannt
Prinzip der Methode:
Es handelt sich bei der Methode um den Nachweis von spezifischer DNA. Der Testansatz enthält die aus den Bakterienzellen isolierte Doppelstrang-DNA, einzelne Nukleotide, 2 kurze Stränge von spezifischer Einzelstrang-DNA (Primer) und die hitzestabile Polymerase (Taq-Polymerase) in einer geeigneten Pufferlösung.
Im 1. Zyklus wird bei Temperaturen von >90°C der Doppelstrang der DNA geschmolzen (Denaturation), und der Testansatz wieder auf ca. 55°C abgekühlt. Falls ein Gegenstück vorhanden ist, werden die Primer dort angelagert (Annealing oder Hybridisierung). Die Polymerase verlängert die DNA Stränge von den beiden Primern aus und es entstehen zwei neue bis zu maximal 3000 Basen lange doppelte DNA Stränge (Elongation, Polymerisation), die zwischen den beiden Primern liegen. Im 2. und den weiteren bis zu 30 Zyklen wird dieser kleine DNA Strang erneut geschmolzen und neue Primer angelagert. Einen animierten Film über den Ablauf der Reaktion kann man unter www.lukopolis.de/biomain.php?biopage=pcr aufrufen. Sichtbar und messbar wird die Reaktion (Vorhandensein einer Gensequenz, die zu den Primern passt durch einen Farbstoff (SYBR Green 1), der sich spezifisch mit Doppelstrang DNA anfärbt. Je mehr doppelsträngige DNA vorhanden ist, umso stärker ist das Fluoreszenzsignal.
Nachweis von MRSA aus Primärmaterial:
Die Oxa-(Methi-)cillinresistenz bei Staphylokokken beruht auf veränderten Proteinen (PBP2a) in der Bakterienzellwand, die eine Aufnahme des Antibiotikums in die Bakterienzelle minimieren. Das PBP2a wird durch das mecA Gen auf dem Bakterienchromosom codiert.
PCR Teste der 1. Generation beruhten auf zwei Amplifikationen (Multiplex PCR). Zum einen wurde ein für Staph. aureus spezifisches und zum anderen das mecA Gen mit spezifischen Sonden nach Hybridisierung nachgewiesen. Eine relativ hohe Rate falsch positiver Ergebnisse (bis zu 15 %) waren dadurch zu erklären, dass neben Oxacillin sensiblen Staph. aureus (MSSA) Oxcacillin resistente Staph. epidermidis (MRSE) vorhanden sein können.
Bei den real time PCR Testen der 2. Generation sind die Primer so gewählt, dass die in das Staph. aureus spezifische orfX Gen integrierte Staphylococal Chromosomal Casette (SCCmec) amplifiziert wird, die in unmittelbarer Nähe des mecA Gens liegt (siehe Abbildung). Es sind mehrere Typen der SCC bekannt. Deshalb werden in den kommerziellen Testen mehrere Primerpaare verwendet, um möglichst alle genetischen Varianten zu erfassen. Es kann zu falsch negativen Ergebnissen kommen, wenn ein bisher unbekannter SCC Typ vorliegt.
Prinzip der Methode:
Es handelt sich bei der Methode um den Nachweis von spezifischer DNA. Der Testansatz enthält die aus den Bakterienzellen isolierte Doppelstrang-DNA, einzelne Nukleotide, 2 kurze Stränge von spezifischer Einzelstrang-DNA (Primer) und die hitzestabile Polymerase (Taq-Polymerase) in einer geeigneten Pufferlösung.
Im 1. Zyklus wird bei Temperaturen von >90°C der Doppelstrang der DNA geschmolzen (Denaturation), und der Testansatz wieder auf ca. 55°C abgekühlt. Falls ein Gegenstück vorhanden ist, werden die Primer dort angelagert (Annealing oder Hybridisierung). Die Polymerase verlängert die DNA Stränge von den beiden Primern aus und es entstehen zwei neue bis zu maximal 3000 Basen lange doppelte DNA Stränge (Elongation, Polymerisation), die zwischen den beiden Primern liegen. Im 2. und den weiteren bis zu 30 Zyklen wird dieser kleine DNA Strang erneut geschmolzen und neue Primer angelagert. Einen animierten Film über den Ablauf der Reaktion kann man unter www.lukopolis.de/biomain.php?biopage=pcr aufrufen. Sichtbar und messbar wird die Reaktion (Vorhandensein einer Gensequenz, die zu den Primern passt durch einen Farbstoff (SYBR Green 1), der sich spezifisch mit Doppelstrang DNA anfärbt. Je mehr doppelsträngige DNA vorhanden ist, umso stärker ist das Fluoreszenzsignal.
Nachweis von MRSA aus Primärmaterial:
Die Oxa-(Methi-)cillinresistenz bei Staphylokokken beruht auf veränderten Proteinen (PBP2a) in der Bakterienzellwand, die eine Aufnahme des Antibiotikums in die Bakterienzelle minimieren. Das PBP2a wird durch das mecA Gen auf dem Bakterienchromosom codiert.
PCR Teste der 1. Generation beruhten auf zwei Amplifikationen (Multiplex PCR). Zum einen wurde ein für Staph. aureus spezifisches und zum anderen das mecA Gen mit spezifischen Sonden nach Hybridisierung nachgewiesen. Eine relativ hohe Rate falsch positiver Ergebnisse (bis zu 15 %) waren dadurch zu erklären, dass neben Oxacillin sensiblen Staph. aureus (MSSA) Oxcacillin resistente Staph. epidermidis (MRSE) vorhanden sein können.
Bei den real time PCR Testen der 2. Generation sind die Primer so gewählt, dass die in das Staph. aureus spezifische orfX Gen integrierte Staphylococal Chromosomal Casette (SCCmec) amplifiziert wird, die in unmittelbarer Nähe des mecA Gens liegt (siehe Abbildung). Es sind mehrere Typen der SCC bekannt. Deshalb werden in den kommerziellen Testen mehrere Primerpaare verwendet, um möglichst alle genetischen Varianten zu erfassen. Es kann zu falsch negativen Ergebnissen kommen, wenn ein bisher unbekannter SCC Typ vorliegt.
In Deutschland und den USA. sind u.a zwei Testsysteme verbreitet. Zum einen der Xpert™MRSA von Cepheid (CE) und der GeneOhm™MRSA von BectonDickinson (BD). Einen Überblick der Leistungsdaten laut Packungsbeilage im Vergleich zur Kultur mit chromogenen Kulturmedien findet sich in der folgenden Tabelle. Die Sensitivität dieser PCR, die auch als „Schnellteste“ bezeichnet wird, im Vergleich zur Kultur liegt in etwa bei 90%, was auch an Problemen bei der Extraktion der DNA aus den Bakterienzellen oder einer Hemmung der PCR z.B durch Blutbeimischung liegen kann. Das bedeutet konkret, dass jeder 10. Fall mit der PCR unentdeckt bleibt.
Eine Amplifikation, ohne funktionsfähiges mecA Gen (leere Kassette, keine PBP2a Bildung) führt zu falsch positiven Ergebnissen. Das führt zu einem niedrigen positiven Vorhersagewert (PPV) von weniger als 80% für den BD Test
(Farley J.E. et al.) Das bedeutet, dass in über 20 % der Fälle Patienten isoliert würden, obwohl dies nicht erforderlich ist.
Eine Amplifikation, ohne funktionsfähiges mecA Gen (leere Kassette, keine PBP2a Bildung) führt zu falsch positiven Ergebnissen. Das führt zu einem niedrigen positiven Vorhersagewert (PPV) von weniger als 80% für den BD Test
(Farley J.E. et al.) Das bedeutet, dass in über 20 % der Fälle Patienten isoliert würden, obwohl dies nicht erforderlich ist.
Stamper et al. (2011) untersuchten 23 Fälle von im BD-MRSA Test im Vergleich zur Kultur falsch positiven PCR Ergebnissen. Die Autoren ziehen den Schluss, dass positive PCR Ergebnisse durch die Kultur bestätigt werden
sollten. Blanc et al. (2011) ermittelten mit dem GeneXpert Test. in einem Kollektiv von 211 Patienten 61 Patienten mit positivem PCR Ergebnis und negativer Kultur. Bei 28 Fällen(12,9%) war Staph. aureus nachweisbar, aber es fehlte das mecA Gen. Die PCR wird zur Kontrolle des Sanierungserfolges nicht empfohlen, da das mecA Gen
länger nachweisbar ist als vermehrungsfähige Bakterien bzw. PBP2a. Dies kann aber auch der Fall sein, wenn ein erfolgreich sanierter Patient wieder zur Aufnahme kommt. Studien hierzu liegen noch nicht vor.
Nicht zu unterschätzende Probleme sind auch die der Logistik. Damit ein PCR Ergebnis tatsächlich nach 2 Stunden vorliegen kann, muss entweder ein sehr rascher Transport in ein externes Labor gewährleistet sein, und dort -oder vor Ort- geschultes Fachpersonal 24h 7 Tage die Woche zur Verfügung stehen.
Das Anlegen einer Kultur zur Erstellung eines Antibiogramms sollte immer parallel zur PCR erfolgen und wird
auch von den Herstellern empfohlen. Da eine Übertragung von MRSA in den ersten 24 Stunden des Krankenhausaufenthalts nur selten erfolgt (Professor C. Wendt, Univ. Heidelberg, pers. Kommunikation), und nach dieser Zeit ein orientierendes kulturelles Ergebnis in der Regel vorliegt, ist eine PCR zum MRSA Screening nur selten erforderlich.
Dr. Susanne Bauerfeind
Mikrobiologin
Zentrallabor
FEK Neumünster
Literatur:
1. Testbeschreibung XPert™MRSA
2. Testbeschreibung BD GeneOhm™™ MRSA ACP
3. Farley JE, et al., JCM(46), 2008, 743-746
4. Stamper PD et al., JCM (49), 2011, 1240-1244
5. Blanc DS et al., JCM(49), 2011, 722-724
sollten. Blanc et al. (2011) ermittelten mit dem GeneXpert Test. in einem Kollektiv von 211 Patienten 61 Patienten mit positivem PCR Ergebnis und negativer Kultur. Bei 28 Fällen(12,9%) war Staph. aureus nachweisbar, aber es fehlte das mecA Gen. Die PCR wird zur Kontrolle des Sanierungserfolges nicht empfohlen, da das mecA Gen
länger nachweisbar ist als vermehrungsfähige Bakterien bzw. PBP2a. Dies kann aber auch der Fall sein, wenn ein erfolgreich sanierter Patient wieder zur Aufnahme kommt. Studien hierzu liegen noch nicht vor.
Nicht zu unterschätzende Probleme sind auch die der Logistik. Damit ein PCR Ergebnis tatsächlich nach 2 Stunden vorliegen kann, muss entweder ein sehr rascher Transport in ein externes Labor gewährleistet sein, und dort -oder vor Ort- geschultes Fachpersonal 24h 7 Tage die Woche zur Verfügung stehen.
Das Anlegen einer Kultur zur Erstellung eines Antibiogramms sollte immer parallel zur PCR erfolgen und wird
auch von den Herstellern empfohlen. Da eine Übertragung von MRSA in den ersten 24 Stunden des Krankenhausaufenthalts nur selten erfolgt (Professor C. Wendt, Univ. Heidelberg, pers. Kommunikation), und nach dieser Zeit ein orientierendes kulturelles Ergebnis in der Regel vorliegt, ist eine PCR zum MRSA Screening nur selten erforderlich.
Dr. Susanne Bauerfeind
Mikrobiologin
Zentrallabor
FEK Neumünster
Literatur:
1. Testbeschreibung XPert™MRSA
2. Testbeschreibung BD GeneOhm™™ MRSA ACP
3. Farley JE, et al., JCM(46), 2008, 743-746
4. Stamper PD et al., JCM (49), 2011, 1240-1244
5. Blanc DS et al., JCM(49), 2011, 722-724